ELEKTROFORESIS

RINGKASAN ELEKTROFORESIS

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.

Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kuat io, pH, temperatur, viskositas, adsortiitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan

Ada beberapa jenis Elekroforesis, diantaranya:

1. Elektroforesis dengan Kertas Saring

Pada akhir proses elektroforesis komponen dengan elektroforesis kertas saring tersebut terpisah-pisah, mereka dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.

2. Elektroforesis Gel Kanji

Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida.

3. Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)

SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bercas tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein piawai yang diketahui berat molekulnya (Rajah 5). Piawai protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.

4. Elekroforesis Wilayah

Ada berbagai factor yang mempengaruhi laju perpindahan elektroforesis wilayah. Factor-faktor yang mempengaruhi pergerakan ion adalah mobilitas ion, tipe resolusinya, macam larutan buffernya, pH yang digunakan, kuat ion zat terlarut, temperature, ada atau tidaknya fenomena elektrolisis atau elektroosmosis. Medium yang umum digunakan adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrilamida dan bubuk gel.

5. Elektroforesis Tirai (Elektroforesis Kontinyu)

Elektroforesis kontinyu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara kontinyu. Suatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam larutan buffer. Suatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel masuk dalam aplikator dari suatu reservoir sampel. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua ruang elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan komponen terpisahkan dalam berbagai permukaan

Prinsip Elektroforesis

Jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinyu kearah katoda atau anoda sesuai dengan muatan partikel. Fenomena ini adalah elektroforesis

Peralatan Dan Metodologi

Secarik kertas saring dibasahi dengan suatu elektrolit dan direntangkan secara horizontal diantara dua ruang elektroda yang berbeda potensial. Sampel diletakkan ditengah-tengah lembaran kertas. Lembaran kertas diletakkan diantara dua lempeng kaca untuk mencegah penguapan elektrolit.

Arus searah digunakan pada beda teganan sekitar 100-300 volt, elektroda yang digunakan karbon dari platina. Kombinasi elektromatografi dengan aliran pelarut yang simultan untuk memisahkan zat-zat inik juga telah dikembangkan.

Aplikasi

Aplikasi analisis dengan Elektroforesis ini adalah seperti dalam “EKSPRESI PROTEIN PADA MIKROORGANISME RESISTEN LOGAM BERAT Cr DENGAN METODE ELEKTROFORESIS”

Elektroforesis SDS-PAGE untuk mengetahui ekspresi protein mikroorganisme.

Sebanyak 5 mL kultur bakteri dituangkan kedalam tabung ependorf 1,5 mL dan sel-selnya diendapakan dengan disentrifugasi selama 5 menit 13.000 rpm. Endapan sel dibersihkan dari media LB cair dengan membuang supernatannya, pelet sel yang mengendap disuspensi dengan Phospat Buffered Saline Solution (PBS) sebanyak dua kali, kemudian disentrifuse kembali, dan supernatant PBS dibuang. Pelet kemudian ditambahkan 1 mL PBS. Untuk memecah sel digunakan sonikasi selama 30 detik sebanyak 4 kali, disentrifuse ulang dan diambil supernatannya untuk dirunning dengan menambahkan buffer sampel (4:1/v:v).

Sebelum diloading ke dalam sumuran, campuran sampel dan buffer sampel direbus dalam air mendidih selama 2 menit, kemudian dimasukkan ke dalam es selama + 5 menit, setelah itu sampel siap dirunning. Gel yang sudah terbentuk (discontinous ge 10 % dan stacking gel 3%), dipindahkan ke dalam tangki elektroforesis (Hames & Rickwood, 1990).

Selanjutnya tangki elektroforesis diisi dengan running buffer (0,19 M Glycine, 10 ml SDS 10 %, dan 0,0248 M Tris dalam 1 Liter) hingga penuh. Letakkan 10 μL mikropipet campuran sampel dan buffer sampel dan masukkan dalam sumuran elektroforesis secara hati-hati. Setelah semua sampel masuk dalam sumuran pasang tutup tanki dan atur voltase (100V, 90 menit).

Pewarnaan dengan menggunakan metode Comassie Blue untuk pewarnaan protein. Larutan dibuat dengan komposisi 1 g zat warna Comassie. Blue dilarutkan dalam 1 L larutan destaining (100 ml asam asetat, 400 mL metanol, kemudian diencerkan dengan penambahan akuades hingga mencapai volume 1 L). (Hames & Rickwood,1990). Setelah dirunning, gel direndam dalamlarutan pewarna Comassie Blue selama 12 jam, kemudian dicuci dengan destainig sebanyak 3-4

kali selama 2 jam hingga didapatkan pola pita protein yang terbentuk.

Ekpresi Protein pada Mikroorganisme Resisten Logam Berat Cr dengan Metode SDS-PAGE

Hasil running dari lima macam mikroorganisme diantaranya K. pneumonia, Pantoea sp, P. aeruginosa, P. putida, dan S. Cerevisieae yang masing-masing sampelnya diekstrak dari sel-sel mikroorganisme yang ditumbuhkan dalam kultur LB cair dengan konsentrasi Cr(VI) 0 ppm dan 10 ppm. Dua macam konsentrasi ini dipilih untuk membedakan antara populasi mikroorganisme yang resisten dengan yang tidak resisten. Pola Pita protein hasil running dengan menggunakan gel polyakrilamid seperti terlihat pada Gambar 3.

Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari campuran polypeptida (Hames & Rickwood, 1990). Marker protein yang digunakan memiliki rentang beratmolekul 212 kDa- 11,3 kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat sejumlah pita protein yangmemiliki ketebalan berbeda-beda. Protein yang memiliki ketebalan dan intensitas warna yang lebih besar dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap variaetas disebut protein mayor (Wijaya & Rahman: 2005). Pada hasil elektroforesis di atas terdapat beberapa buah protein mayor pada spesies P. aeruginosa (M3) dan P. putida (M4). Berat molekul dari protein mayor ini berkisar 148,7 kDa, 121,6 kDa, dan 105 kDa. Kedua species ini memiliki protein mayor yang intensitas warna dan ketebalan yang hampir sama karena kedua mikroorganisme ini masih termasuk dalam genus yang sama yaitu Pseudomonas.